大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的原理

原理：

轉(zhuǎn)化（Transformation ）：將外源DNA 分子引入受體細(xì)菌，使之獲得新的遺傳性狀。

受體細(xì)菌一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，不含限制性?xún)?nèi)切酶 和甲基化酶的突變體（R-,M-），可以容忍外源DNA 分子進(jìn)入體內(nèi)并穩(wěn)定地遺傳給后代。受體細(xì)胞經(jīng)過(guò)一些特殊方法，如電擊或CaCl₂ 、RbCl/KCl等化學(xué)試劑的處理后,細(xì)胞膜的通透性增高，成為感受態(tài)細(xì)胞（Compenent cells），使外源DNA 分子得以進(jìn)入。

目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有CaCl₂ 和RbCl/KCl法，RbCl/KCl法制備的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率較高，但CaCl₂ 法簡(jiǎn)便易行，且其轉(zhuǎn)化效率完全可以滿(mǎn)足一般實(shí)驗(yàn)的要求，制備出的感受態(tài)細(xì)胞暫時(shí)不用時(shí)，可加入無(wú)菌甘油至總體積15％，于-70℃保存半年之久，因此CaCl₂ 法為使用更廣泛。

準(zhǔn)備：

1、配制0.05mol/L CaCl₂ -15%甘油混合溶液，高溫高壓滅菌；

注： CaCl₂ 必須為分析純以上。

2、實(shí)驗(yàn)中所需的所有試管 、培養(yǎng)瓶 、離心管 等均要用去離子水徹底清洗干凈，高溫高壓滅菌；

注： 有制備感受態(tài)細(xì)菌專(zhuān)用的一套實(shí)驗(yàn)器材。

3、受體菌的培養(yǎng)：從非選擇性L(fǎng)B平板上挑取E.coli單菌落,接種于3-5ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中后期。將該菌懸液以1:100的比例接種于50~100ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)2.5小時(shí)至OD₆₀₀ =0.5。注：培養(yǎng)時(shí)間不宜超過(guò)2.5小時(shí)，否則不能達(dá)到轉(zhuǎn)化效率。

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