細胞凋亡是一種細胞主動有序的死亡，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等作用，它并不是病理條件下自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為了更好地適應生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡。本期恒遠生物給大家介紹細胞凋亡檢測實驗的方法，一起來學習下吧！
一、PI 單染色法
1. 收集細胞｛數(shù)目約（1~ 5）×106 個/mL｝，500 ~ 1000 r/min 離心 5min，棄去培養(yǎng)液。
2. 3ml PBS 洗滌 1 次。
3. 離心去 PBS，加入冰預冷的 70%的乙醇固定，4℃，1—2 小時。
4. 離心棄去固定液，3mlPBS 重懸 5min。
5. 400 目的篩網(wǎng)過濾 1 次，500—1000r/min 離心 5min，棄去 PBS。
6. 用 1ml PI 染液染色，4℃避光 30min。
7. 流式細胞儀檢測：PI 用氬離子激發(fā)熒光，激光光波波長為 488nm，發(fā)射光波波長大于630nm，產生紅色熒光分析 PI 熒光強度的直方圖也可分析散射光對側散射光的散點圖。
8. 結果判斷：在散射光對側散射光的散點圖或地形圖上，凋亡細胞與正常細胞相比，散射光降低，而側散射光可高可低，與細胞的類型有關；在分析 PI 熒光的直方圖時，先用門技術排除成雙或聚集的細胞以及發(fā)微弱熒光的細胞碎片，在 PI 熒光的直方圖上，凋亡細胞在G1/G0 期出現(xiàn)一亞二倍體峰。如以 G1/G0 期所在位置的熒光強度為 1.0，則一個典型的凋亡細胞樣本其亞二倍體峰的熒光強度為 0.45，可用雞和鮭魚的紅細胞的 PI 熒光強度做參照標準，兩者分別為 0.35 和 0.7，可以確保在兩者之間的不是細胞碎片而是完整的細胞。
注意事項：
細胞凋亡時，其 DNA 可染性降低被認為是凋亡細胞的標志，但這種 DNA 可染性降低也可能是因為 DNA 含量的降低，或者是因為 DNA 結構的改變使其與染料結合的能力發(fā)生改變所致。在分析結果時應該注意。
二、Annexin V/PI 雙染色法
1. 細胞收集：懸浮細胞直接收集到 10ml 的離心管中，每樣本細胞數(shù)為（1~5）×106，/mL 500~1000r/min 離心 5min，棄去培養(yǎng)液。
2. 用孵育緩沖液洗滌 1 次，500~1000r/min 離心 5min。
3. 用 100ul 的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育 10~15min。
4. 500~1000r/min 離心 5min 沉淀細胞孵育緩沖液洗 1 次。
5. 加入熒光（SA-FLOUS）溶液 4℃下孵育 20min，避光并不時振動。
6. 流式細胞儀分析：流式細胞儀激發(fā)光波長用 488nm，用一波長為 515nm 的通帶濾器檢測 FITC 熒光，另一波長大于 560nm 的濾器檢測 PI。
7. 結果判斷：凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如 PI 有抗染性，壞死細胞則不能。
總結：細胞膜有損傷的細胞的 DNA 可被 PI 著染產生紅色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產生。因此，在細胞凋亡的早期 PI 不會著染而沒有紅色熒光信號。正常活細胞與此相似。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI- ）
三、Heochst 33342/PI 雙染色法
1. 懸浮生長的細胞在培養(yǎng)的狀態(tài)下加入 Heochst 33342 ，終濃度為 1ug/ml； 37℃孵育7—10min。
2. 低溫 500 ~ 1000r/min 離心 5min 棄去染液。
3. 加入 1.0ml PI 染液，4℃避光染色 15min。
4. 400 目的篩網(wǎng)過濾 1 次。
5. 流式細胞儀分析：Heochst 33342 用氪激光激發(fā)的紫外線熒光，激發(fā)光波波長為352nm，發(fā)射光波波長為 400 ~ 500nm，產生蘭色熒光；PI 用氬離子激光激發(fā)熒光，激發(fā)光波波長為 488nm，發(fā)射光波波長大于 630nm，產生紅色熒光。分析蘭色熒光對紅色熒光的散點圖或地形圖。
6. 結果判斷：在蘭色熒光對紅色熒光的散點圖上，結果為：正常細胞為低藍光/低紅光，凋亡細胞為高藍光/低紅光，壞死細胞為低藍光/高紅光。
注意事項：
① 在紅色熒光對蘭色熒光散點圖上，還可見到細胞凋亡區(qū)向細胞壞死區(qū)遷移的軌跡，可能是凋亡細胞的 DNA 進一步降解的緣故。
② 用 Heochst 33342 染料與細胞孵育的時間不宜過長，一般控制在 20min 之內為宜。如果太長可引起 Heochst 33342 的發(fā)射光譜由藍光向紅光的遷移，導致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變，從而影響結果的判斷。
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